竞争性透析：结构选择性核酸结合研究

简介

目前，药物研发多以蛋白质为靶标（包括各种酶和膜蛋白），而鲜少以DNA为靶标，主要是忽略了小分子选择性结合到基因组中功能性DNA序列的能力，同时也因为缺乏实用又简单的检测方法。而事实上，对于新药研发来说，以特定基因为靶标并下调其功能的药物，对于遗传性疾病的治疗具有巨大的潜力，即“抗基因”策略，其优势在于：目的基因在细胞中的拷贝较少，所以使用较少的药物分子即可有效干扰转录和翻译过程，即抑制基因功能。相应的，较低的治疗剂量可降低副作用的发生。

传统的药物-DNA结合研究，主要关注药物对DNA序列的选择性。而实际上，DNA结构的多态性在基因表达中也发挥了重要作用，对于这方面的研究，常通过结合/热变性的方法比较配体与标准双链DNA或其它结构DNA结合特性的差异来进行比较，但这种方法单次测试数量较低，不能全面了解配体的结合能力。新一代的高通量竞争性微量透析技术，很好地解决了这一难题。

透析是指一种或多种溶质扩散通过半透膜的过程，常用于去除杂质或换液。竞争性透析是透析的一种衍生，可用于研究待测配体对不同核酸形式的结合特性。

在简单的平衡透析测试中，用半透膜分隔两个半室，将受体置于一个半室，配体置于另一个半室。选择合适的膜，使配体可以自由地从一个半室进入另一个半室，而受体被截留在原来的半室。随着扩散的进行，部分配体会结合到受体，而其余配体会保持游离状态。如果配体与受体的亲和性较高，绝大部分的配体会维持结合状态。当达到平衡时，受体半室中的配体浓度会升高，此时，可使用分光光度法测定每个半室中的配体浓度。

有研究人员通过改良型平衡透析设备研究了配体对GC及AT碱基对的不同结合偏好。在此设备中，将不同碱基组成的DNA样品置于两个不同半室，并在两个半室中间设置一个中央室来放置配体。配体会在三个室间达到平衡，并在偏好的DNA半室具有较高的浓度。

竞争性透析是对改良型平衡透析的“再扩展”，此类装置可容纳一系列不同核酸结构，将其置于含有配体溶液的烧杯中，达到平衡时，整个系统中游离配体的浓度都是相同的，而具有特定结构偏好结合位点的透析单元内总配体浓度将高于其它单元。通过使用96孔板，这种方法得到了进一步的提升，这种装置将矩形的平面透析膜夹在透析容器和96孔样品室之间，样品室的所有微孔可与透析液相接触。每个微孔的样品容量为150-200ul，透析容器的容量为250ml。装置结合了标准96孔板的几何学特性，可使用标准的多通道移液器以及其它96孔板相关技术，并可通过使用特定机械实现自动化操作。

竞争性透析的过程简单，只要准备好核酸原液，即可快速、高效地进行操作。实验设置需要约1h，包括将所需的核酸原液上样到透析装置。一旦设置完成，即可开始实验。达到透析平衡之后，从透析单元吸出样品，加入SDS解离结合的药物，使用吸光度或荧光度方法检测浓度。